La Certosa fu fondata, nel maggio del 1366, dall'Arcivescovo di Pisa Francesco Moricotti, per adempiere alle volontà testamentarie del mercante pisano, di origine armena, Pietro di Mirante della Vergine. Essa sorse in un luogo vicino a Pisa, detto “Valle buia”, appellativo in seguito mutato in “Valle gratiosa”, perchè toccata dalla Grazia divina, per la presenza dei monaci. L'edificio si ampliò lentamente grazie alle elargizioni di ricche famiglie pisane, immortalate, sul finire del Settecento,in nome ed in effigie, dal pittore pisano Pietro Giarrè, nelle finte nicchie dipinte dal pisano Luigi Pochini nel corridoio delle Foresterie Nobili, dette anche Foresteria della Madonna, per la presenza di un affresco raffigurante la Madonna con Bambino. Anche le celle dei monaci venivano edificate via via che i benefattori ne consentivano la realizzazione, intorno allo spazio, ancora indefinito, del chiostro. Negli ultimi decenni del XIV secolo furono completate sia le strutture cenobitiche (il Refettorio, il Capitolo, la Chiesa), sia le abitazioni dei conversi. Il convento acquistò particolare importanza politica dopo l'annessione dell'antico monastero benedettino dell'isola di Gorgona, nel 1425.

In seguito alle soppressioni napoleoniche degli ordini religiosi, nel 1808, anche la comunità certosina di Calci fu sciolta e trasferita nel convento vallombrosano di San Torpè a Pisa; gran parte degli arredi sacri in argento vennero inviati alla zecca di Firenze per essere fusi, e molti volumi dell'Archivio e della Biblioteca, insieme ad alcuni dipinti, furono venduti. Nel 1814, durante il granducato dei Lorena, i certosini ritornarono a Calci e, grazie all'opera del Priore Lessi, gran parte del patrimonio artistico della Certosa fu restituito o riacquistato sul mercato antiquario. Nel 1866, durante il Regno dei Savoia, un nuovo decreto sancì la soppressione della Certosa e gli edifici, le opere d'arte, l'Archivio e la Biblioteca, divenuti del demanio statale, furono affidati al Ministero della Pubblica Istruzione. I certosini hanno abitato il convento fino al 1972 quando, ridottasi la comunità religiosa a due soli monaci, il monastero è stato soppresso per diventare Museo Nazionale.